"7° Congresso nazionale delle Biotecnologie" - organizzato dall'Università degli Studi di Catania, in collaborazione con Consorzio Interuniversitario delle Biotecnologie (CIB) e con il patrocinio della Regione siciliana, della Provincia regionale di Catania, del Comune di Catania e del Parco scientifico e tecnologico della Sicilia, del Consiglio nazionale delle ricerche (CNR) e dell'Accademia Gioenia (presso l'Aula Magna della Facoltà di Agraria - polo bioscientifico, Via Santa Sofia, 8 - 9 - 10 settembre 2004)

Va bene ma giriamo che i veramente interessate a questa Šešelj medica dai tecnologi che chiude la sessione scientifica
Del dell'interessantissimo CNP sette che abbiamo avuto qui a Catania siate voi ecco qualche amico che sta arrivando gli altri saranno interessati probabilmente alle altre sessioni
Quindi e cominciamo con la presentazione
Dell'università di Modena dal titolo lode City laico proteine del Sector transfer in Ford fa fu John proteine invio approdassero il fascio evaluation e se potesse alterati otto il tour for Lovarini plasma di alla colesterolo
Che verrà presentata dalla dottoressa Giorgia Razzini
Spero sia qua però qua benissimo allora il pacco eletti avevo un giorno i dati di questa presentazione si riferiscono essenzialmente ad un lavoro che abbiamo pubblicato quest'anno su Human citati
Poi brevemente le proteine a bassa densità le cosiddette LPL sono responsabili del trasporto della maggior parte del colesterolo plasmatico ai vari compartimenti cellulari essenzialmente l'interazione avviene tra la componente proteica pochi cento di cui appunto i costi sono costituite le del PdL con il ricettore cos'hai detto note recettore appunto a bassa densità
La mancanza o comunque l'alterata funzionalità del recettore stesso dovuta a mutazioni e ormai a tutt'oggi ne sono note almeno seicento e comunque il dato in continuo aggiornamento determinano quello che è lo sviluppo
Di una malattia autosomica dominante appunto nota come l'ipercolesterolemia familiare
Da un punto di vista
Prettamente biochimico questa patologia si caratterizza per elevati livelli di colesterolo circolante che ovviamente come avete e potete vedere dalla tabella nel caso degli eterozigoti e ancor peggio nel caso degli omozigoti risulta essere almeno cinque volte quello che è il valore normale
Appunto in soggetti normali anche il numero di recettori presenti sulla superficie cellulare risulta assolutamente diminuito addirittura nelle nel caso degli omozigoti si arriva a valori intorno a zero
Da un punto di vista in invece appunto clinico ormai è noto che alti livelli di colesterolo LPL risultano essere un fattore di rischio
Per lo sviluppo di aterosclerosi quindi di cardiopatie coronariche e infine appunto con infarto al miocardio che nel caso di soggetti omozigoti avviene anche appunto ha un'età molto precoce intorno ai vent'anni
Altri fattori diciamo che contraddistinguono la malattia sono lo sviluppo di ex Antonia a livello cutaneo livello dei tendini largo corneale
Il trattamento il trattamento è diverso ovviamente nel caso in cui la patologia sia più grave e quindi le case degli omozigoti rispetti invece al caso degli eterozigoti centralmente
Gli eterozigoti possono comunque trarre beneficio da una ditta alimentare dall'utilizzo di vari
Farmaci quindi da un approccio puramente farmacologico
Io ho riportato semplicemente le statine perché fosse solo comunque diciamo la classe di farmaci più note mentre nel caso
Degli omozigoti l'unica terapia che effettivamente a diciamo Successo nonostante sia una pratica molto laboriose nonostante quindi la
Diciamo le sue feto sia comunque tra il presidente è l'LDL aferesi ovviamente essendo comunque una malattia genetica anche qui l'approccio di terapia genica è stato è stato così investigato
Fino ad ora l'unico trial clinico diciamo in pazienti umani è un approccio ex vivo in cui epatociti da pazienti o omozigoti sono stati trapiantati tradotti con un retrovirus codificante il recettore delle LDL era impiantati
Perfetto diciamo curativo terapeutico è risultato essere solamente marginale probabilmente perché il numero di epatociti e scritte effettivamente tradotti era comunque basso
Al momento altri trial clinico trial clinici invii possono invece solamente applicati a modelli animali di per colesterolemia
Nel nostro laboratorio è stata sviluppata un approccio terapeutico alternativo questo approccio e diciamo stato si basa essenzialmente su due evidenze sperimentali
La prima analizzare andò quella che ha praticamente la struttura del genere codificanti per il recettore delle Dl quindi anche la struttura protetta corrispondente nasce dal fatto che esiste in natura una mutazione nota come la F H duecentosettantaquattro che causa la delezione degli esoni e codificano per due importanti domini che sono il membra in e il Saito plastiche Domenico cioè che cosa comporta questo questa delezione comporta la formazione di un recettore cosiddetto solubile
Perché manca di tutti quei domini che gli permettono di essere ancorati alla membrane quindi di essere internalizzato
Quello che invece non viene alterata e la funzionalità a livello appunto del legame la la capacità di essere secreta e poi appunto quella di essere dissociata a livello degli endo sogni oltre che il dominio di glicosilazione che ne aumenta la stabilità
La seconda evidenza sperimentale nasce dal fatto che esiste una sovrapposizione tra quello che è il meccanismo di internalizzazione delle LDL il meccanismo di internalizzazione della transferrina entrambi cioè utilizzano quello che è noto come meccanismo di indurci Tosi immediata
Dove appunto nel caso delle LDL in interazione con le LDL restart ora
Causa l'immaginazione quelle che sono le
Chiatti QT Izzo e quindi queste vescicole di Katrina
Che vengono portate a livello degli End Zone livello dicendo Sonia pH acido siamo andati sotto Bytom malissimo non riesco a indicare bene
Se ha comunque una dissociazione del Complesso recettore legando il recettore ricicla verso la superficie quindi di nuovo disponibile per altri per altri padri appunto di internalizzazione mentre il Complesso colesterolo LDL se ne va verso il lo so mi dove viene degradato
Ah trasferiva internalizzate lo stesso modo legandosi a quella che è la recettore della transferrina stesso
L'altra cosa diciamo che è stata utile il fatto che comunque anche recettore della transferrina diciamo distribuito ben distribuito a livello degli epatociti questo era un fattore determinante ovviamente
Per garantire l'internalizzazione del colesterolo a livello del fegato che vi ricorda l'organo deputato all'iscrizione al metabolismo del colesterolo attraverso le vie biliari
Pertanto ormai diversi anni fa sia appunto costruita questa proteina diffusione io adesso la chiamerò sempre o proteina chimerico bruttina di fusione proprio per la brevità
Che è caratterizzata dalla fusione appunto della sequenza del DNA codificante per questa forma tronca del recettore ecco appunto recettore solubile della lady agli umani
Fusari né mantenendo Frendy lettura con la sequenza intera della transferrina di coniglio prescelta inizialmente di appunto mettere la sequenza di coniglio è stata dettata dal fatto che uno cioè il miglior modello animare l'ipercolesterolemia noto e appunto il coniglio di watt Anabel capannoni per collezione in via del tutto
Sovrapponibile a quella umana
Le caratteristiche della proteina chi merita
Sono quelli appunto di essere fondamentalmente una proteina solubile e quindi che può essere fondi sintetizzata da qualsiasi tipo di tessuto non è necessario tra sedurre un particolare organo il fegato queste invece l'utilizzo e l'approccio terapeutico appunto delle della terapia genica con l'utilizzo del recettore delle LDL
è comunque capaci di legare le LDL perché quello che non viene attraverso il dominio N terminale
Perché quello che non viene intaccata la sua capacità appunto di legami ed è internalizzate quindi stupisce la mancata funzionalità del recettore di internalizzare
Attraverso invece il recettore della transferrina e quindi alle gambe transferrina recettore trasferì Nikko
I dati che qui vi riassumo sono ormai stati pubblicati nel novantanove ci ricorda anche che la pratica chiari che è stata brevettata e fondamentalmente dalla costruzione della di questa sequenza e l'espressione della sequenza e quindi la proteina sotto un conto il controllo del promotore sia in V cioè visto che le cellule tra aspettate sono in grado di produrre quindi di tradurre la bruttina correttamente al peso molecolare atteso di chi così larga quindi esiste in realtà appunto una forma anche così Late Cinquini c'è un aumento del peso e questo è ovviamente atteso e soprattutto viene secreta quindi essendo una proteina solubile ci aspettavamo di trovarla in quello che era appunto il terreno delle cellule così è stato
è stata assaggiata in testi in vitro la capacità di legare le di agli umani marcate e questo si è verificato e infine ancora una notte interessante si è visto che la proteina chimerico in grado di mediare quello che è il legame l'internalizzazione la degradazione di LDL marcate in modelli appunto di ipercolesterolemia rappresentati dal titolo Blasi di coniglio diventa labile
Qui non ho riportato prime importante dire che il legame specifico con le LDL con l'eguale D Alema non con le Hdl
E questo è molto importante perché se appunto le colesterolo LDL un fattore di rischio il colesterolo Hdl invece risulta essere un fattore quasi di prevenzione quindi è importante che non si andasse ad alterare quel
Pattuito
Allora i dati indietro ovviamente erano molto interessanti quindi risultava importante puoi fare quella che era l'espressione in vivo e quindi andare sui modelli animali ne abbiamo scelto una tecnica abbastanza semplice comunque relativamente giovane che nota come tecnica di ai tre dinamiche una tecnica appunto l'idrodinamica è una tecnica di trasferimento genico non di reale che avviene attraverso un'iniezione nella nella coda dei topi di una grosso volume di soluzione salina contenente il DNA plasmidi con nudo intorno a un valore intorno ai cinquanta microgrammi
Quindi se ne deve essere molto molto rapida riportato cinque sette secondi e quindi il volume deve essere grande deve essere quando dico grande intendo dire due punto cinque mele per un topino di dimensioni di venti venticinque grammi
I parametri che sono la velocità con cui si inietta il volume sono assolutamente fondamentali sono dei parametri critici
Per garantire quello che è un efficiente trasferimento genico
Che ha avviene a carico principalmente del fegato
Ancora il meccanismo di
Dell'idrodinamica scusi Patrizio dinamica non è noto sembra che non sia mediato da recettori specifici quello che noto è che qua ovviamente questa iniezione crea uno scompenso cardiaco il topo che comunque tollera sufficientemente bene per rimanere in di vivo
E
E questo scompenso cardiaco crea praticamente un reflusso tradendo attraverso la vena porta che aumenta la porosità degli epatociti quindi
Quello che avviene una sorta di trascrizione in vivo essendo nata aspettano Indino e anche una trascrizione tra aziende nel senso che purtroppo questa tecnica ha una sua diciamo a un sul limite che quella dell'espressione che ovviamente non è duratura
I primi dati sono riferiti appunto al
Analisi della proteine della presenza della proteina in quello che era ovviamente il plasma di questi topini che abbiamo scelto inizialmente
Sono stati prima trattati degno d'mai se l'abbiamo visto che comunque la proteina si esprimeva per poco tempo quindi non c'era problema di risposta immunitaria
E pertanto siamo anche a parer passati a trans dure carta tecnica appunto topici di uno e ieri topici di uno sono stati iniettati e e il Plastic è stato prelevato ai clienti che vuol dire mi dette segnati e tramite queste ridotti in analizzata la presenza della proteina
La presenza della partita inizia entro otto ore dall'iniezione tende ad aumentare si mantiene stabile
Se ciò otto trentasei ventiquattro ex essenzialmente due giorni dopodiché è comincia a diminuire e a cinque giorni purtroppo non era più presente a quelle concentrazione comunque con il limite di detection del West Ham plotting non riuscivamo più a vedere la proteina
Vi ricordo che la proteina appunto a un aumento del peso molecolare dovuta la glicosilazione patteggiati modificazione post tradizionali evidentemente in vivo rispetta in vitro questa è la proteina purificata sono diversi
Abbiamo anche cercato di fare una stima quantitativa della produzione di questa
Della nostra Plotina e quindi lungo tutto quello che è stato il periodo di cinque giorni
Abbiamo attraverso analisi del sito metrica valutato la concentrazione in confronto con una quantità nota di Cortina purificata da cellule cose abbiamo visto che il picco massimo di produzione sia intorno
A quelle che erano le ventiquattro ore posti iniezione ha una concentrazione di circa trentacinque cinquanta microgrammi per Mele di plasma non è male
Un'altra caratteristica io ero ovviamente noi la proteina riusciamo a produrre la indico e questo è un punto abbastanza fondamentale ma bisogna anche vedere che i Proci sa Menta livello dei compartimenti cellulari in vivo non alterasse quella che era la sua attività di legame pertanto abbiamo ripetuto il saggio di timing
Cosa ne ha LDL umani marcate ventiquattro ore quindi ventiquattro ore è stato scelto poi come il tempo migliore dove avevamo la quantità massima di proteina circolante
Che come potete vedere esiste appunto la capacità di questa dello Stato Tina di legare l'LDL umani marcati esiste questa sola banda che in analogia con la patina purificata dal cielo le cose
E non è evidente ovviamente nessuna banda né il plasma dei Totti controllo che sono stati trattati con la stessa tecnica ma ovviamente quel plasmide vuoto
Tramite Western plotting stripping abbiamo verificato che ovviamente il peso molecolare fosse corretto
E quindi che la proteina appunto in grado di legare LDL umane marcate
Un altro dato molto interessante è quello che ha verificato la capacità poi di rimozione delle LDL quindi la capacità di fare clearance ITO appiccichi Juno ventiquattro ore prima del esperimento di clearer sono stati tradotti con il plasmide
E di controllo e il nostro plasmide esprimente la proteina chi me ricca e poi e iniettati appunto con LDL umane marcate la capacità di rimozione e quindi quella che riportati in ordinata è la diminuzione della radioattività associata l'LDL
Risulta essere anticipata
E circa novanta minuti rispetto a quello che succede nei CD uno cioè il valore massimo tenuto che intorno ai trentacinque quaranta per cento di diminuzione effettivamente sia a trenta minuti dall'iniezione questo cosa vuol dire vuol dire che esiste un effetto additivo
Della nostra Platina chi merita rispetto a quella che è la funzionalità del recettore ovviamente dei CD uno che sono comunque Totti che fanno clearance
Allora era molto interessante vedere in un sistema a come appunto il knock-out e per il recettore delle LDL qual era l'effetto della proteina in modo tale da avere una correlazione diretta della proteina rispetta clearance
I topi knockout per il recettore della lady alle non sono topi di per sé a ipercolesterolemia ci a meno che non vengano sottoposti a una dieta ricca di lipidi perché appunto hanno un metabolismo riescono a fare clearer fa attraverso la componente A pochi quarantotto
Allora come potete vedere esiste quindi nel nel caso dei controlli che sono quelle con il pallino vuoto
Una Tires assolutamente ridotta il caso degli animali invece tradotti con la nostra più Pinocchi né ricca il tasso di clearence risulta direttamente proporzionale alla concentrazione della proteina circolante
Questi topi effettivamente sono stati raggruppati per quantità di proteine come si può vedere quando la quantità di proteine mo'e alta paragonabile a quello che si verifica normalmente Necci di uno effettivamente abbiamo una curva del tutto sovrapponibile a quella dei CD uno decidi uno topi e quello che non succede poi il fatto che effettivamente c'è una saturazione Rossi arriva a livelli cioè la la Pires viene mantenuta
Perché evidentemente c'è una saturazione da parte della del ligando LDL da parte della nostra Aprutina
E quindi di Totti continua a fare questo a mantenere questo valore di clearence
Sì divenuti finito
Un altro punto fondamentale la presenza della transferrina ovviamente una delle cose che ci vengono normalmente Mosella transferrina comunque potrebbe portare la proteina in compartimenti diversi da quelli che normalmente sono deputati del recettore delle dei Dl
Pertanto nelle stesse condizioni sperimentali che gli ho mostrato abbiamo verificato se la presenza della proteina chimerico a fosse in grado di alterare quella che era la distribuzione e l'LDL umane marcati in termini su tali e questa si ferì fico si riferisce appunto un'immagine di una gamma camera acquisizione
Di due topi controllori trattati con la nostra proteina che si può notare che effettivamente compartimenti sono gli stessi fegato Vichy calcolo abbiamo chiamato regione mediastiniche tiroide quello che è interessante notare è che rispetto
Al topo controllo nel caso appunto dei topi iniettati quindi che esprimono Aprutina circolante siamo aumentata teche dirà di attività a livello del fegato quindi questi topi in presenza della pratica chi merita portano maggior materiale a livello del fegato
E ovviamente questo a un certo punto diminuisce contestualmente aumenta la presenza di radioattività a livello della vescica
A livello appunto della vescica quello che arriva è un maggior quantità una maggior quantità di prodotti di catabolismo derivanti da una maggior clearence e quindi vediamo che AT&T minuti effettivamente inizia la potete superiore del topo trattato rispetto al controllo
In conclusione quindi possiamo dire che utilizzando questa tecnica abbastanza semplice siamo stati in grado di produrre la proteina in viva e di ritrovarla in circolo che la consentì la concentrazione maggiore di protegga circolante raggiunte intorno alle diciotto ventiquattro ore dopo il trasferimento genico ma che comunque la l'espressione diciamo diminuisce circa una settimana
Viene mantenuta la capacità di legare le Dl è ovviamente di fare chi eresse in topi iniettati con l di alle umane senza comunque alterare quello che il pattern generale appunto di Bellelli Dl a take
Quello che brevemente quelle che sono le e prospettive sono ovviamente quello cui di andare in questi modelli animali resi per con le strade vicine caso delle LDL non Cauto pure del coniglio diva Tana Abe e ovviamente di prolungare quella che l'espressione transgenica per poter vedere riduzione del colesterolo aterosclerosi preventivo prevenzione dell'aterosclerosi
Pertanto abbiamo sviluppato già sviluppato un vittoria dell'ordinario di prima generazione e un altro che appunto diciamo in preparazione
Sotto il controllo di un promotore fatto specifico nell'idea che effettivamente confinare l'espressione genica livello di alcuni tessuti Possa comunque mitigare quella che la risposta immunitaria
E questo è semplicemente il dato appunto così in cellule cose di espressione della proteina stessa proteina espressa con il promotore ti chiama per verificare Vito in vivo e la stessa cosa ringrazio il professore Stefano Ferrari che qui seduto che ovviamente il capo laboratorio e la dottoressa Parise che gli appunto divide con me questo Progetto e tutti gli altri collaboratori grazie
Grazie dottoressa se se ci sono delle domande dei commenti
Ci sono Isidori
Grazie naturalmente complimenti domanda nel momento in cui si riuscisse poi ad avere alti livelli di espressione
C'è il timore che possa esserci competizione poi per la transferrina ovvero il recettore dovrà poi decidere oppure pensiamo di avere livelli recettore tali per cui
Microfono al microfono
Diciamo che comunque il già il il dato interessante che l'abbiamo ottenuto c'ha comunque permesso di stare in un margine di sicurezza Celli intessuti sono gli stessi nel caso in cui ci sia la proteina o non c'è la proteina penso che comunque sono le espressioni in viva a lungo termine potrà dare le risposte effettive anche di competizione e quindi anche di deposizione magari di colesterolo intessuti extra epatici questo non così potrebbe esserlo vivamente
Ci sono altre domande
Per un commento è certo che la prospettiva terapeutica presso l'uomo è abbastanza lontana visto anche
La pesantezza del sistema di trascrizione no allora diciamo che quando io questi dati sono dei dati gialle il utilizzata la tecnica delirio Dina ma non assolutamente nessuna presunzione di andare verso quello che è la l'uomo ma semplicemente di dare dei dati che ci permettono poi di sviluppare il modello
Perché il a e altre no ecco muoviamo perché siamo un po'un pochino indietro non per colpa nostra perché la nostra prima spicca l'estate nei tempi allora se prossimo aspettare di Mancini Brusacà la brocca Longhi pagnotta Santucci Masotti
E al titolo sa chi vende penne attacca in virtù h Activity ATE g quanto espandere estero inglesi stanno croniche mi rode Lucchini ha e non potete emopoietiche progenitori studio ettaro sindaca Canesi inibitore e stili Christine no estivo ai fai Seven o Anna
è lei io sono Santucci e non sostituisco mensili che non è potuta essere qui oggi
Vi parlo di una malattia che alla luce nemmeno vede cronica che è una sindrome mieloproliferative Elettronica che trae origine in un progenitore manto politico
Multi potente che è una malattia relativamente rara ma che ha rappresentato negli ultimi venti trent'anni un modello di studio di Leucippo genesi particolarmente utile particolarmente utilizzato
Perché una delle poche neoplasie che a un gene malattia
E i e nel quale quindi possono essere correlati gli spettri di trasformazione all'evento genetico che sta alla base il Gene malattia della leucemia mieloide cronica e il genere arrangiamenti genere arrangiato bisserà adesso Anna che trae origine dall'altro secrezione reciproca nove ventidue che identifica che che identificata morfologicamente accusava di Filadelfia che è stato riconosciuto nelle Risi degli anni Sessanta del nove
E
Nell'ambito di questa trasmutazione reciproca sempre nove ventidue se vengono vengono a essere giustapposte le sequenze abrasione a partire dal secondo Esone su cui del sul cromosoma nove a una sequenza
Del club Osama ventidue che prende che che si chiama dissi Arbre torrente cluster igiene
Il prodotto degenerati arrangiato dissi era adesso non è una proteina chi medica che nel caso specifico da decenni almeno Elettronica compreso molecolare di duecentodieci chiedo da Alton
Una né tifosi inchinarsi costitutivamente attiva in cui la il la chinasi del dominio adesso non è costituita da mente attiva in una compartimento cellulare quello citoplasmatico che è illegittimo
Beh la costitutiva attivazione di queste TIR Lusi inchinarsi in un compartimento che è illegittimo perché il suo legittimo compartimento di attivazione sarebbe quello nucleare
Ka del
Da alle e il progetto regionale della leucemia mieloide cronica un vantaggio proliferativa sulla controparte normale che è dovuta alla costitutiva attivazione divieti trasduzione del segnale mito e genico quelle normalmente
Coinvolte nella
Nella proliferazione tu a seguito dell'esposizione a fattori di crescita
E in in genere anche modificare caratteristiche adesiva arbitro abbiente midollare che sono restrittive per la proliferazione e inoltre
è induce una resistenza alla morte apporta ottica sia per la e dedizione del segnale troppo tattici che era per la preparazione di segnali anti aborto Pizzi
A questo consegue che la aumentata proliferazione la diminuzione della morte caso non legittima espressione del compartimento Lecce nemico a spese di
Del compartimento
No beh ematopoietiche o normale
Ora la
Dunque la è conoscenza di questo evento molecolare cruciale nella patogenesi e poi vedremo anche nella progressione della malattia ha permesso di di utilizzare del CBM valga cronica come la prima patologia neoplastica in cui è stato utilizzato un farmaco cosiddetti intelligente c'è un farmaco capace di targhe tale elemento patogenetico
Che è una inibitore della trasduzione del segnale che sta che identifica poi le sigle delle farmaco utilizzato
Per nella nella trial clinico si si che in altre stazioni inibitore schiavi che e è un farmaco che va a competere accollati Intini e per il legame con il per il legame alla tasca catalitica della che in Asia persone e con questo la spende
Essendo bloccata l'attività terrosi inchinarsi che ATP duecentodieci viene a mancare alla popolazione velocemente a un segnale di proliferazione è un segnale di sopravvivenza cruciale
E quindi sia un ripristino della induzione della morte a botta ottica e un ripristino del controllo di proliferazione
E inesistenti la esperimenti e che hanno preceduto alla introduzione di questo farmaco nella clinica nel nel venne la terapia di questa malattia hanno fatto vedere che i la questo estiva e cinque sette uno che la prego
Anche penso a letto
Sulla stampa il Comune che ne come si è alzato col nome di Clivet governanti in altri venne siglato
Induce una morte selettiva dei progenitori planare delle ultimi abbiano ed economica inducendo nella morte a botta ottica e in una minoranza di questi reintroducendo
L'arresto nella fase non della fase quiescente del ciclo cellulare
In accordò quando ricco anch'esso sono cominciati i
Entrai semplici di fase uno e poi seguiti da quelli di fase due
Chi come me si è sempre occupato di leucemia mieloide cronica coltivato il sogno che finalmente si potesse si disponesse di un farmaco capace di curare una malattia che altrimenti pure in un tempo lungo ha sicuramente un esito fatale
La morte
Prevalente seguito della somministrazione del farmaco è la morte a Porta ottica sia una riduzione anche molto rapida molto più rapide di quelle che si era vista anche con interferone che già aveva rappresentato
E vuole innovazione terapeutica in questa malattia della una prelati definire sette del
Leuci della componente giornale delle matto Pogliese una remissione ematologica completa nell'ottanta per cento dei casi di pazienti con leucemia mieloide cronica cui fa seguito circa dal sesto mese in poi
Una remissione cito genetica in alcuni casi anche una remissione molecolare
Nel venti e trenta per cento dei casi ora i trials clinici sono cominciati circa tre anni fa per cui è troppo presto per una malattia che ha una vita media di circa cinque anni
Per trarre delle delle conclusioni definitive
Sui vantaggi clinici della terapia e con e stia ai cinque sette uno esperienza precedente con interferone che data dalla metà degli anni ottanta ha però dimostrato che i pazienti che vanno incontro a una remissione
Citogenetica maggiore completano una grossa probabilità di essere
Di essere guariti dalla malattia
Abbiamo dunque sanato magico per questa malattia no purtroppo no non l'abbiamo perché si è visto che il c'è un un fenomeno che se no manco della fama con resistenza che anche per spiare gioca un ruolo
Importante nella risposte Dell'Atti a questo farmaco questa farmaco resistenza rare volte è si presenta all'inizio del all'esordio clinico di malattia ma nella maggioranza dei casi insorge ai tempi variabili tu
Tanto il trattamento e probabilmente a a tre anni dall'inizio di di tra espliciti controllati noi ancora
Sotto stimiamo l'entità della farmaco resistenza de per questo spirito tipo speciale di Farneto
Su questo si è studiato tantissima perché è ovvio che e ci dovranno essere fermati bloccati tanti altri Circuiti altri circuiti biomolecolari a valle
Di disse arabe sono che sono rileva e che possono essere attivati in contemporanea
All'attività dell'atropina chimere che quindi si devono trovare delle combinazioni fermati farmacologiche giuste e degli algoritmi di somministrazione di questi farmaci giusti le mutazioni
Le
H
Responsabile dell'affannato resistenza sono mutazioni al carico del dominio occhi nasi copiava sono di altri domini delle proteine ti medica che impediscono l'accesso del farmaco alla tasca atterriti cade ad personam
Dove l'espressione del gene diffusione oppure l'attivazione di lire metto igieniche alternative alla Nardi signora persona ma lo stesso capaci di conferire vantaggio proliferativa e resistenza alla morte apporta otite
Ora
Studi nostri anche dei presenti in letteratura identifica non è l'abrogazione della
Checkpoint
G uno S cioè del conto dei meccanismi di controllo di regolazione della transizione attraverso
La il punto di restrizione tra giugno e messe del ciclo cellulare un momento molto importante nella patogenesi della leucemia mieloide cronica perché ecco finalmente una incontrollata
Transizione attraverso questo punto deciso il cellulare Causio neri li legittima espressione della
Nello pugliesi clonale
E anche della progressione della malattia perché l'abrogazione del ceppo anche oggi uno S
Causa l'instabilità genomica che che che permette poi l'acquisizione di mutazioni genetiche genomi che molecolari aggiuntive che scandiscono l'evoluzione alla crisi plastiche terminale
Ora la invece quante G uno messe regolato dall'attività di un complesso
Sinai sì che ci ricatta due quale Fossoli elettrodotto diretti noblesse Tomat permetterà dell'ascendenza tanta discrezionali durezza che poi iniziano Sperlonga processo dell'obiezione del DNA e su nell'attività di cicli Nancy di K due interventi intervengo non una miriade di geni che incide su tutti i geni oncosoppressore che agiscono attraverso meccanismi trascrizionale tipico p cinquantatré
Attraverso il P ventuno che ha quarantacinque e quant'altro
E palustre scrisse anali ora noi abbiamo interessi in valutando i meccanismi di FI di attività di espiare cinque sette uno sui progenitori Donadel ci mia mieloide cronica
Abbiamo identificato questa via di iniziati accatta due civici venticinque a
Cos'è che finisce sull'attività DC di K due come una via alternativa è molto rapida di induzione dell'arresto proliferativa dei progenitori della leucemia mieloide cronica
Sì questa è una via che è un è stata identificati come una via della radio risposte se anche a K due è un essere in prima Minchin Haase che viene attivata fosforilata interno posizionati parte particolare dal gene Atm
Una volta fosso arrivate attivata causa la fosforilazione di una fosfatasi CDC venticinque ha che ha in condizioni normali alla funzione di rimuovere nel fosso relazioni in atti Banti in tre mila quattordici chiusi nel quindici DC di K due quando questa viene fosforilata grazie anche al K due
La
Viene il accanto la fossa la sua fa sua redazione la indirizza alla proteolisi ubiquitina un riproduciamo dipendente ubiquitina dipendente
E venendo a mancare in questa fossa Attanasi sì di K due rimane fosforilata in queste posizioni nati Banti e quindi
Inattiva e quindi le cellule sia all'esterno in fase G uno ter di paese precoce guardando le fette di Este ai cinque sette uno noi abbiamo visto che
Quando ci ricatta due sia a riattivare a venticinque a ventiquattro ore dalla somministrazione del farmaco indietro
In un momento in cui P duecentodieci è ancora de force corredata questo ci ha suggerito che ci di K due l'attività di siti K due il recupero dell'attività DC di K due
Possa rappresentare un meccanismo di esche precoce dall'effetto del farmaco e di conseguenza abbiamo speculato che questo passa rappresentare anche un meccanismo di resistenza al farmaco
Noi abbiamo utilizzato come modello sperimentale dei cloni deriva una linea cellulare Bury di progenitori ematopoietiche sicuri nella trentadue dieci che è molto utilizzata per questo tipo di esperimenti
Presentata con un costo molto tempo sensibile in temperatura
Di bisserà adesso andare che a l'attività curiose il cui prodotto attività chiusi in chi Nasica
Se le cellule vengono mantenute a temperatura permissiva di trentatré gradi ma non ce la sede cellule vengono mantenuti alla temperatura non permissiva di trentanove gradi
Voi vedete che l'attività abbiamo il premier preliminarmente dimostrato che l'attività
Vieste ai cinque sette uno è strettamente dipendente dalla presenza dell'attività Teresi inchinarsi che tipi duecentodieci questa l'accusa di sopravvivenza trentatré gradi
Con un ente di cinquanta intorno a zero zero zero treni con di diserzione treni pro morale questa è la curva di sopravvivenza tre della stessa delle stesse cloni a trentanove gradi voi vedete che praticamente abbiamo una
Scusa un tantissimo più alte comunque granelle di cinque anni
Per questi cloni
Tradotti con questo costrutto particolare abbiamo derivato attraverso meccanismi di clonazione
In presenza di dosi del farmaco di circa zero cinque metro morale
Abbiamo ottenuto dei cloni resistente al farmaco e in questi siamo andati a valutare per prima cosa i livelli di trascritto
Di bisserà persona per identificare appunto seria resistenza in questi giorni era mediata o non era mediata
Dal unna ove l'espressione del gene malattia
Abbiamo scelto quattro cloni
Che abbiamo identificato e dei due due quattro due uno otto due uno uno otto P quattro per i treni e abbia in cui la la legge né malattia e sotto Espresso o norma Espresso e abbiamo associato una condizione sperimentale che è rappresentata dal padrone
E in presenza del fattore di crescita interleuchina tre che è un meccanismo l'industria che era presente tutta di per se stesso un meccanismo di riduzione di farla quell'esistenza
è e inesistenti
La turco è dimostrato qui dal da una rete di cinquanta circa otto micro morale
In effetti però mettono in radio resistenti ad Atene farmaco resistenti abbiamo escluso che la secrezione autopulenti interno che in altre rappresentanze il meccanismo di resistenze al farmaco ci sono i quindici minuti sono finiti quindi dei soldi allora vediamo che e la proteina P duecentodieci è in tutti meno uno cloni dei fosfori latte dal farmaco ma l'attività di c.d. K due nei fanno insieme nei cloni resistenti estremamente elevate questo acciacco attratta questo avviene attraverso diversi meccanismi che convergono sul cd K due
Per cui noi suggeriamo come conclusione che ci di K due possa essere considerato come un targhetta ci a addizionale all'attività tre distinti basica
Mi P duecentodieci per la terapia della leucemia mieloide cronica ed esistono oggi
Dei farmaci e lei entrare alcun già sperimentati in transito fase uno
E in ogni caso suggeriamo per attività enzimatica DC di carta due possa essere un elemento indicativa responsività del farmaco dei pazienti all'esordio clinico di malattia
E grazie scusa sto sosta no no no no vol non è reato per presentare a poppa qualche segnale che converge verso il cd K due metri magari importante le cose del messaggio importante che ci dica tra due può essere così
Sono può essere considerato nelle ricerche a dire no per fare un accidente mettere in combinazione Tremestieri lo Saccucci di capo dove ci sono parecchi prodotti gli studiosi sono non hanno anch'esso non hanno possibilità quelli che possiamo usare un laboratorio ancora di utilizzo clinico malessere in plaude anche notare che esse sono fuori con dei frammenti trambusto sono da sempre sì stanno lavorando
Ci sono tre commenti
La rete regolazione e veramente interessate vediamo
Sandro graduando brevissima questo risultato che pure trovato in un background mieloide compì duecentodieci
Dovete controllato anti in un perché era un cellulare linfoide conti centonovanta il si confermano non l'abbia fatto con P. centouno ma l'abbia fatto studiate DF tre che a me non piace come Mother perché rifarebbe
E conto transitato con P duecentodieci sempre questo ma dunque
Non ho fatto il centonovantotto dei dati preliminari comunque lavora anche sufficiente novantadue esprime che risolve spesso
E grazie
E andammo alla comunicazione di Perino Lazzi Lambertini borgate barioni Piva e Campari questa di Ferrara ecco vedete abbiamo la via Emilia qui moderna Bologna e Ferrara
è presente una pre una comunicazione dal titolo spezzo Déco in buone consentano che tiene FFO Kebi trascrizione fatto non apoptosi groviglio umano tramare Ostia cluster
Altri racconti
Bongiorno
Allora io sto clasti insieme Ariosto plastica stizziti come in alto fanno parte la così detta Basic moti sale una unit che è la struttura che deputata al mantenimento delle masse scheletrica
E in particolare questo plastico SCT sono deputati alla formazione dell'osso mentre gli osteoclasti al suo riassorbimento
Spesso è la stessa facendole Muccino piatte sono di origine ematopoietiche nati in particolare della linea ma troppo comune Cittalia
Il meccanismo che porta alla formazione dello stesso astro matura passa attraverso una serie di di steppa i meccanismi piuttosto complesse che in parte è vero qui schematizzato
Sicuramente la molecola più importante arranca da che ligando del settore attivatore viene effettuata Biche può essere presenti in forma solubile a livello ematico oppure portato erano entrati prevosto Blas terzino destro mali
Questo ora anche una volta che interagisce con i ranghi che corre tra i precursori innesca quella che la via differenze attiva una molecola che lo step tesserina impedisce l'interazione garantire l'ampia inoltre ci sono un'altra serie di attivatore inibitore in particolare interleuchina uno sei e undici le prostaglandine il parto ormone le necessarie per innesca nati differenze attiva mentre i Tigers detta la vitamina D attivata il tre sette dette stretto io lo tendono ad impedirlo
Un malfunzionamento degli asset Casti legato una sensorialità una serie di patologie in particolare per esempio se Petronzi e caratterizzate da una diminuita attività dello step pilastro mentre se c'è una prevalenza dell'attività oste plastica rispetto all'oste plastica
In c'è può ipossico intervenire in di masse di patologia seppe anche quale presente il modo di precedere osteoporosi o anche l'artrite reumatoide
Approfondimento dello studio sulla STET Castro Genesi
Ha portato all'individuazione della se di fatto è trascritta navali che intervengono differenziamento tra da precursore fino ad essere la stonatura
Questi fattori sono molti alcuni degli ha indicati quali presente nel fatto di un ossigeno si fosse soprattutto ENEL seccata di recettore per gli estrogeni
Il settore per le stragi niente assoluta importanza in particolare il in presenza di alti livelli di di estradiolo e in grado di regolare una giusto bilanciamento tra attività o se plastica sto classica
E quindi garantire una normale turn-over a livello del tessuto osseo racconta nel particolare quale può essere presente la donna e lo stato di menopausa diminuiti livelli di estradiolo
Portano a una iperattività dello step casto e quindi non incrementata riassorbimento dell'osso
Il nostro Progetto era difficile intervenire in questa condizione particolare e che può e indurre una serie di patologie quindi aumentato riassorbimento dell'osso intervenendo su due di fatto ricco anche prima elencato quali sono e recettore dell'estrogeno e pennette KB
La strategia che abbiamo utilizzato è la strategia di cui e in particolare quello che vogliamo fare e riuscire e attraverso questa questa notizia a indurre l'apoptosi negli Ossi o plastica
E lo studente noti posto plastico si possono usare diversi modelli sicuramente i modelli animali sono quelli che vengono normalmente utilizzati l'abbiamo ospitato un sistema può più laborioso che consiste nelle in culture primario di ostetricia Asti Humanité direttamente a sangue periferico e il cui sistema che m'ha detto un pochino più complessa o però sicuramente ci avvicina subito a quello che target finale del nostro
Del nostro del nostro progetto che l'uomo
Tecnicamente per allestire una cultura Tremaglia sto classi si passerà si parte da una sacca di sangue si separa la linea bianca di particolari monociti
E sottoponendoli per quattordici giorni ha questi induttore differenze amento arrivati quattordicesimo giorno la presenza di Ostia clasti maturi viene valutata verificando la
Positività due Marcatori che sono appunto le MM Pinotti elementi ventinove e l'altra perché la posta Tasia citata tratto resistente questa positività permane per una settimana dal quattordicesimo al ventunesimo giorno
Ma e il tempo che che abbiamo fondamentalmente peluche allestire e i nostri sperimenti
Pigliamo verificato se una molecola de quo in particolare uno Arrigo De Sossi Bono Clotilde contro Agassi KB potesse indurre l'apoptosi tenendo conto che emette Cappabianca ruoli importanti perché riesce a bloccare la morte cellulare programmata
E abbiamo disegnato una sequenza leggono più ti dica che conteneva i bagni Saita appunto per emerse KB Gavina sotto verificato mediante sa che fosse in grado di interagire con annesse caparbi questa abbiamo valutato in Cervetti Citti ventitré che sono c'era lo sto cast simili
Quindi una volta verificato quattordicesimo giorno che le cellule fossero costo Casti maturi
Abbiamo ripetuto per due giorni un trattamento dei quella concentrazione del microgrammi a belle e dopo un giorno di Stasi le cellule venivano fissate successivamente analizzate
Anzitutto abbiamo visto che il trattamento fino a due microgrammi NL come concentrazione non avevano effetto citotossico
Evidenti nelle cellule
E le quali colorate per esempio ha con ematossilina
Dopo trattamento non non cambiamo la loro morfologia rimanevano così appunto come vedete mutino piante
Quindi non questo trattamento non influiva sulla circa cito tossicità tuttavia sedevamo attraverso il testa il pannello appunto a verificare il il nucleo pop tolti circa mentre nei controlli
E anche in cellule trattate con il veicolo che appunto erano di posa mica ti ho amici
Oltre che con no dicono Colchide non relato non si presentavano copia pop tolti sì selezionando le invece vengono trattate con l'olivo che abbiamo disegnato aumenta il numero di uno che ha quattordici
In particolare si va quasi all'ottanta per cento
Di Luca quattordici rispetto ai lupi totali
Quindi posso sicuramente dire che il trattamento che ha individuato in grado di indurre apoptosi in o se piastre umani e questo vediamo anche dimostrato gli aumentati livelli dica sparse e di notte la specificità dell'azione eleviamo verificata analizzando i livelli di interleuchina sei seguito del trattamento intero china Serge le targhette di Mf KB
E vi hanno visto che appunto questi livelli diminuivano mentre i livelli endogeni di tenesse KB risultava inalterati
Abbiamo inoltre verificato se variando dosi e tempi e nel trattamento questo influirà sui direzionalità pop Tosi e mentre passano da ventiquattro settantadue ore non c'era una sensibile variazioni se venivano dimezzate raddoppiate le dosi
C'era effettivamente una variazione del numero dei lupi apoptosi siccome dimostrano anche le immagini sottostanti su un po'sbiaditi
Quindi e l'alito che abbiamo disegnato era in grado di indurre apoptosi per siccome il nostro gol finale era quello di pensare ad un'applicazione reale e nei momenti in cui lavorava passare su all'il vivo pure Alex vivo Sami mediatamente scontrati con un problema di stabilità di efficace che sicuramente Hidalgo di Protti di sintetici avevano quindi in collaborazione col processo penale di Napoli abbiamo tentato di disegnare una molecola particolari che sono appunto delle chimere PNA Gianni Napier mia
Che presentavano i bagni Insight perenne se KB ed al dado essendo in particolare abbiamo individuato tra diverse possibilità
Che sono nel DNA PD PD i PTP DNA e lato picchi nera Pdp Pdp
Questi chimere erano in grado di interagire con emerse KB come dimostrano questi saggi Enza
Ed inoltre riuscivano a spiazzare l'interazione tra illogico diciamo quel tale perché abbiamo usato finora e n.s. KD Effetto che non si verificava nei momenti in cui venivano usati Olivo diversi
Diamo quindi anche verificato se effettivamente avevano stessa effetto biologico e attraverso il sempre testa tanto nel fatto in culture primarie più stocastica
Abbiamo visto che i livelli di apoptosi che uscivano ad ad innescare erano sicuramente paragonabili con lo leggo che avevamo usato fino adesso
Quindi una prima parte di conclusioni posso sicuramente dire che ne fu il KB è un buon targato Bonifato e trascrizionale target per intervenire sulla passato tra percussore ed oste casto maturo
Inoltre che potrebbe rappresentare una terapia di cui una strategia per la terrà il trattamento di una serie di di di patologico stupendi che e può essere anche pensata come alternativa
Terapie tradizionale che quelle che vengono tutto utilizzati che prevedono l'uso non so di bifosfonati analoghi del resto è logica di calcitonina
Tenendo conto che questi trattamenti hanno molte vantano molti vantaggi ma sono anche molti evasivi nette presenta la strategia del cui potrebbe garantire come opportuno sistemati delivery una applicazione localizzata
Seconda parte del mio progetto mi sono occupato invece di un altro fattore trascrizionale che abbiamo già visto che il recettore dell'estrogeno che come avevo già in parte premesso queste in grado di aumentare l'attività di inibire l'attività di fattori che stimarono lo step la sto Genesi ed incrementare quelli che invece la inibiscono
Da da anni il nostro gruppo di lavoro ci occupiamo della NASA la Regione cinque primo del generale fa di particolare abbiamo individuati anche brevettato una molecola particolare che evacuarono li abbiamo chiamati ora a quarantuno
Che appartiene ad una Regione promotrice del gene e da a un siti di interesse né per putativi una serie di fattori prescrizionali e e comunque abbiamo già dimostrato essere in grado in vari modelli cellulari di incrementare i livelli di recettore per l'estrogeno
L'abbiamo utilizzato in cultura primario chiesto Plastic e cosa abbiamo visto
Abbiamo visto che anzitutto dopo trattamento i marcatori Delfino ti posso classico non cambiavano mentre aumentavano enormemente i ribelli e di Ralph Erbetta che sono le due isoforme di questo recettore per l'interazione consolidando
I livelli di apoptosi allora vi ha visto un aumento di numero di un cappotto alticci rilevati dal TAR nelle e anche un incremento dei livelli di casta se tre mentre l'attività cito tossica di questo caso Nasten'cito tossica non era stata non è stata evidenziata
Inoltre via visto che questo tipo di trattamento agiva solo sugli osteoclasti maturi per queste qui questo grafico rappresenta i livelli di apoptosi con potete vedere prima del quattordicesimo giorno il trattamento kora quarantuno non fa assolutamente nulla
Mentre lo fa nel trattamento dopo il quattordicesimo giorno e anche per trattamenti ripetuti
Quindi seconda parte appunto delle conclusioni anche nel settore delle stragi non può essere un un buon targata per la modulazione e passaggio appunto tra precursori e do sto classi maturi inoltre la anche la molecolare a quarantuno de quo e che ho individuato
Potrebbe essere utilizzata per un futuro a una futura applicazione terapeutica anche per esempio per riuscirà a migliorare l'effetto che può essere un trattamento con degli estrogeni
Quindi complessivamente attraversa strategie del cui riuscire a diminuire cioè in a controllare negativamente l'azione ghanesi KB ed incrementale evidenti recettore dell'estrogeno
Può essere utile per mandare in apoptosi gli osteoclasti in questo momento ci stiamo occupando fondamentalmente riuscì a disegnare delle molecole
Da applicare nella in questo in questa età strategie sperimentali e Dio me tanto efficace quegli instabilità di passare anche adattamento de cui sull'animale soprattutto animali qual type oltre che ad animali questa ti do Turatto una patologia come gli animali o stupore ottici
Ed inoltre riuscire a fare questo tipo di trattamento in un sistema particolare che sono appunto le con culture sto Glasses Plastic mal di uscire a verificare l'effetto che può avere un trattamento de cui sul bilanciamento tra attività di entrambi
Grazie
Sono ci ha dato una bellissima per la comunicazione ma anche guadagnato un minuto quindi
Ci sono delle domande
Queste grandi
Il problema dell'animale sì noi ci stiamo già provando Samoggia approvando mi
Più che per quella delle patologie per intervenire in in ortodonzia una cosa un'applicazione un po'particolare
In realtà in questo momento abbiamo cioè pensiamo di appoggiarsi a degli altri gruppi
Per la delivery e quindi l'utilizzo o di Rosell oppure di di riposo comunque semplicemente sindacando in questo caso particolare però dell'applicazione ortodontiche proprio nel punto
Dove ci può interessare agire su di esso case piuttosto che sugli osteoblasti forse questa cosa non sia stata abbastanza ma e molto specifica cioè tutti e due le mie molecole del coi sputo e nette KB è in grado di quello contenente caparbi di agire sulle ossa classe non sulle aste classico questa cosa interessante perché tenuto conto che comunque prende spunti satura di oggi son compresenti e il fatto di avere questa selettività già esclude una seri problemi
Quindi trattamento locale quanto dura Lebed o
Stiamo iniziando comunque nel nel mio caso particolare e io e trattamenti di devo comunque ripete Cei faccio le fonti su cui sui topi fino ad ora e devono essere ripetuti per due giorni di seguito
In questo caso particolare proprio nel punto dove vengono innescato una serie di di foreste particolare lo spostamento dei denti
E dopo l'animale viene sacrificato per cui sinceramente io l'effetto adesso i dati preliminari devono essere confermati in parte lo vedo
Poi dopo se questo trattamento a livello sistemico eventualmente cosa può provocare tutto da verificare tra sicuramente i primi dati sono un po'se incoraggianti
Se Grasso
Ma magari aggiungere qualcosa sul stessa linea che ha indicato Marte grane nei pochi per verità casi in cui si è andati in clinica con oligonucleotidi ingenera cosa che si è vista e che occorre una enorme quantità di in massa
Di questi composti per ottenere una fetta penso al caso per esempio strategie dirette sono scritte in nel caso della malattia di Duchenne per esempio trattate comma oligonucleotidi
Pensate nel vostro sistema di potere in qualche modo by pass open la sponda sperava e d'individuare fondamentalmente sistemi delle libere opportuna sono stanno facendo passerà anche per cui
C'è una volta messa a punto cosa possono fare e ovviamente la concentrazione che c'è né lancerò la bersaglio secondo me o meno quello che ho imparato finora
Si gioca molto sistema di delivery cioè il fatto che nell'intorno possa essere mantenuto per prestabilita proprio delle molecole utilizzata e per capacità del sistema opportuno rimane la più alta concentrazione possibile per il miglior tempo maggior tempo possibile per cui penso che fosse quella la linea migliore quella però
Si era
Grazie dunque allora passiamo al comunicazione successiva
E da parte del gruppo di Pietro ferro giugno Laganà virgola Pulvirenti pur avendo e Ragusa anti Claxton molti porsi con Sellani mentre Bari anti Paul cluster venti
Presenta dell'università di Catania presente Pulvirenti sì
Buongiorno
Allora
Nessun altro Pulvirenti faccio parte del sadiche manie presentanti Plast arbusti conseguenza la mente by la stringa
Ora questo lavoro è uno dei risultati ottenuti da un gruppo di ricerca presenta ormai da anni presso l'Università di sui di Catania che ha due componenti la prima di informatici proveniente dal Dipartimento di matematica informatica guidati al presso l'Alfredo ferro di cui io faccio parte e la seconda del Dipartimento di scienze biomediche
Guidata al professore Michele porre lo questa nella pagina del nostro sito web dove potrei trovare tutti i software che ne produciamo legati a problematiche biologiche io informatiche quindi non solo antitrust ma anche altri software che ne abbiamo sviluppato
E chiaramente troverete anche tutte le nostre pubblicazioni scientifiche sia dal lato biologico che dall'alto chiaramente informatico
Questo lavoro parte di questo cuore anche svolto in collaborazione col professor degli Sciascia della New York University
Ok uno dei problemi di base della biologia squisito dire moderna e l'allineamento multiplo questo diciamo consiste nel prendere e tre o più più sequenze siano queste nucleotidiche o amminoacidica renderle della medesima lunghezza mediante l'inserimento di un simboli versarle chiamato Gatto
Allo scopo di massimizzare la loro similarità e identificare quindi le affinità che esistono tra le affinità biologi che esistono tra queste bio sequenze tipicamente la similarità viene misurata da una funzione chiamata funzione Discoring
A questo problema esiste una soluzione ottimale chiaramente dal punto di vista informatico però purtroppo questa è altamente dispendiosa in quanto richiede un tempo esponenziale sul numero delle vie sequenze che si intenda lineare quindi ottenere una soluzione ottimale c'è un allineamento ottimale significativo dal punto di vista biologico risulta nessun problema quanto mai difficile quindi la comunità scientifica si è spinta da ormai da diversi anni sin dagli anni diciamo dalla fine degli anni ottanta aiuta di soluzioni approssimate che si avvicinassero quanto più possibile a diciamo l'allineamento ottimale
Un approccio particolarmente vincente quello dell'allineamento della perché ma dell'alimento progressivo e un tour il molto famoso creme del lago nella comunità biologica e sicuramente la Standard Liegi Lupatoto un gruppo di ricercatori della Università di Adolf Berger in Germania
Comunque ci sono altri risultati recenti particolarmente interessanti tra cui ne cito alcuni di Airline Laganà del Maracanà
Ma soprattutto ti costringo software abbastanza recente che risulta essere particolarmente interessante pervio sequenze abbassa similarità
Allora vediamo qual è il nostro approccio a questo problema quindi supponiamo di avere un gruppo DiDio sequenze indifferentemente aminoacidi che Oslo tipiche e superiori di volerla lineare allora ma iniziamo suddividendo queste di sequenze
In
Gruppi di classi omogenee
Allora cercando di mantenere separate io sequenze che risultano essere poco simili cioè molto dissimili all'interno di ogni classe di ogni gruppo omogeneo di più sequenze cerchiamo di identificare una che Semenza che sia rappresentativa della classe
Quindi una volta costruita questa struttura dati che vedremo sarà un albero andremo ad allineare mediante la tecnica l'alimento progressivo
Queste
Questi dati o perché per noi chiaramente sono stati alla base di questa di questa metodologia ci sono e tecnica sviluppata presso l'Università di Catania che chiama la tecnica dei tornei randomizzati
L'accenno brevemente solo per credere chiarire le idee qui sopraelevata vestì oggetti nella fattispecie e bio sequenze
E supponiamo che ci sia all'interno di questo gruppo IBI sequenze un determinato oggetto che minimizza o massimizza una determinata funzione quindi cerchiamo di novellame sopravvenute vista matematico
E supponiamo né di essere interessati alla ricerca di questo elemento allora la pregherei torni randomizzati
Cerca di identificare una soluzione che si avvicini quanto più possibile a quella ottimale
Essa procede nel seguente modo fissato un numero intero che risulta essere piccolo rispetto alla dimensione delle di sequenze su quindi superiori per un gruppo di più sequenze di caparbio sequenze mini dieci venti cinquanta più sequenze
Supponiamo di fissare un numero piccolo ti ad esempio quarant'tre effettuiamo una partizione una suddivisione casuale di tutte le più sequenze che sono presenti all'interno di questo database
E all'interno di ognuna di queste classi cerchiamo di identificare un elemento che minimizza o massimizza la funzione proprio al all'intera chiamiamo quest'evento X
Ignoriamo tutti gli altri elementi quindi raggruppiamo malamente tutti questi vincitori che provengono da ognuno di questo che insieme e ripetiamo questo processo
Fino a quando non identifichiamo un elemento indicato con G Star che rappresenta l'approssimazione del nostro
Elemento che stiamo cercando la nostra bio sequenza che stiamo cercando
Ora questo questa tecnica può essere utilizzata per la ricerca di un elemento centrale all'interno di un insieme un elemento centrale tenenze brevemente può essere definito come quell'elemento
Che minimizza la distanza media da tutti gli altri elementi quindi supponiamo che ne desideriamo perché stiamo cercando una via sequenza
Che risulta essere a una distanza media bassa rispetto tratte seguito per una un'ampia sequenza
Centrale
Se possiamo quindi definire il concetto di centralità tra di sequenze
Ora vi faccio avere in questa dell'animazione come opera questo algoritmo veramente qua siamo sul piano quindi cioè voi tutto semplificato e possiamo osservare banalmente che presi questi questi questi punti elemento centrale risulta essere questo allora suddividiamo queste circostanze in gruppi il nostro insieme all'interno di ogni gruppo cerchiamo di trovare l'elemento che è centrale rispetto agli altri
In questa circostanza le indichiamo in giallo e il rosso indichiamo gli altri due che vengono buttati via quindi applichiamo questo questo procedimento tutti gli elementi presenti nel nostro database e quindi giallo contrassegniamo il gruppo dei vincitori e Ingrosso contrassegnato in quegli elementi che ci può non non ci interessano
Continuiamo la nostra ricerca sul gruppo dei vincitori fino a quando non arriviamo a ad un solo elemento che risulta essere Ciabò la nostra approssimazione del delle vedo che visitiamo chiaramente in questa demo l'approssimazione coincide con le leve col centro esatto però e la realtà capita che essendo diciamo una ricerca approssimata
Talvolta l'elemento che mi ha restituito non coincide con quello effettivo
Ora diciamo questa tecnica di base può essere utilizzata per effettuare cibo con opportune modifiche questi utilizzate per effettuare una suddivisione delle nostre più sequenze in classi omogenei quindi supponiamo di essere in grado identificare un raggio un un una quantità quindi supponiamo innanzitutto di essere in grado di avere una funzione che sia in grado di misurare quanto simili sono due vie sequenze allora e supponiamo bibliche dato determinato ragioni sappiamo che sempre più sequenze superano quella distanza che io ho indicato consiglia
Vedi caro consiglio ma
Allora significa che le due più sequenze per me sono differenti allora diciamo non mi soffermo su queste iscrizioni faccio vedere direttamente
L'animazione che ho preparato quindi partiamo sempre dal medesimo insieme
Con una modifica della tecnica davvero bizzarri che gli ho presentato poco fa cerchiamo identificare all'interno dell'insieme se esiste questa coppia semplifichiamo quindi una coppia chiamiamola ebbi la cui distanza risulta essere maggiore di Sigma allora suddividiamo lo spazio delle nostre di o sequenza in due sotto insiemi quelli che si trovano più vicini adatti lo chiamiamo S. Cona e quelli più vicini che si trova di e ripetiamo questo processo
Sia sull'insieme Segona sia sull'igiene secondi se non siamo in grado di identificare questa coppia allora ci fermeremo e andremo a generare una classe di bio sequenza omogenee e all'interno di essa cercheremo di identificare la sequenza
Rappresentativa quindi proseguiamo all'interno dell'insieme Segona identifichiamo un'altra coppia supera la distanza si ma allora ripetiamo su questi due insegne sia uno S a due in questa circostanza troppe rosso si vede poco mi fermo perché non sono in grado di identificare questa coppia e genero le vie prime due classici è opportuno e ci ha con due proseguo dall'altro lato
E identificò un'altra quindi copia di uno B due anche queste il costante all'istante maggiori di sisma e proseguo fino ad ottenere quattro classi dove all'interno o delle mie sequenze che hanno una un certo grado di similarità
Allora questo dal luogo ad una strutturati ad un albero Monf
E sterminati lo credo che della diciamo anche nella biologia si abbastanza comune che diciamo può essere trattato può essere utilizzato come albero guida per effettuare una un allineamento multiplo
Quindi il termine antitrust al sta per antiporto mastering Airline mentre
Adesso vedremo diciamo brevemente come quindi quest'altro può essere utilizzato per allineare le nostre di sequenze quindi supponiamo mi rappresentiamo le nostre formazioni questo modus prima di avere un gruppo con undici bio dodici due sequenze supponiamo di avere suddivise con la vecchia previste classi omogenee
E adesso cerchiamo di sfruttare questa struttura per effettuare allineamento allora partendo dalla foglia ovvero dalla classe
Diciamo che si trova in basso nell'albero
Parte dalle foglie iniziamo effettuare l'allineamento all'interno di questa classe utilizzando sono delle tecniche informatiche dovute alla algoritmi dovute ammesse Miller in connessione con una modifica di un algoritmo dovuto a mano
Certo gas Speed chiamato star Center triste utilizzando la nostra uno mediana una volta che noi quindi scusate
Quindi una volta che noi abbiamo allineato brigante questa tecnica dello Stars in the street
Allineato due gruppi di bio sequenze dobbiamo cercare di fondere i due gruppi dubbio sequenza Linate in un unico gruppo di più scemenze allineate
E per far questo utilizzando la medesima tecnica che è presentata in la Standard e quindi presentata nella maggior parte gli algoritmi che effetto allineamento progressivo per la tecnica dei profili associamo ad ogni allineamento una tabella di valori che è chiamata profilo e mediante il confronto di questi due profili fondiamo i due lineamenti ottenendone uno
Più grande e riteniamo questo processo quindi risalendo nel nostro albero
Risalendo il nostro albero fino a quando tutte le vie sequenze li andiamo a leggere sulla radice del del nostro albero e risulta essere quindi il nostro insieme di bisonti partenza però allineato
Ok
Vediamo brevemente diciamo le performances di questo metodo che ho appena presentato chiaramente da un punto di vista proprio informatico il rallentamento per il tempo di esecuzione
Che dello strumento risulta essere un fatto interessante ma soprattutto punto di vista biologico la qualità dell'allineamento risulta essere quanto mai una fattore critico si possono definire diverse misure per andare a valutare la qualità di riallineamento ce li si può associare un numero da un punto di vista matematico a quante buon allenamento è diciamo noi abbiamo fatto questo definendo due due
Diciamo metriche per effettuare questa analisi
Allora in questo grafico vediamo alcuni esperimenti che sono stati fatti da prendere sequenze nucleotidiche dal sito Ncd ai alla banca dati sensibili ai utilizzando Beta turbine sulla sinistra abbiamo i risultati
Di quello che il running Tango per il tempo di esecuzione dell'algoritmo nostro che identificato in rosso e in blu abbiamo Granit anche dell'algoritmo del del Tour classe al Barrio sulla destra invece possiamo osservare
Facciamo il né c'era Rescio dei dei due algoritmi che pressoché confrontabile solamente che il
Iran in tanga sotto ritmo chiaramente più basso questi invece sono dei risultati tessono su sequenze
Capirci di Cantù ed abbia utilizzato il benchmark pallipes due sviluppato da gruppo sempre vigili Tom sono però voi gli autori di classe a darli dove effettuiamo un confronto diciamo dove andiamo a calcolare uno scorre chiamato quali scorre è più è vicino a uno questo scorre più si avvicina e l'alimento prodotto a quell'ottimale in quanto questo benchmark valdese un insieme di allineamenti ottimali che sono stati diciamo aggiustati manualmente da coloro che l'hanno costruito
Attualmente e in fase di sviluppo e già abbiamo una prima diciamo release della versione due dell'Antitrust al è la versione due della di last alla lavora in connessione con l'algoritmo i costi che ho presentato brevemente riproduzione Ticozzi è un algoritmo sempre basato sulla linea sull'alimento progressivo solamente che cerca di associare di discriminare né io insieme delle più sequenze associato dei pesi opportunamente
Identificati ora partendo quindi da atti costi quindi Ticozzi costruisce una libreria di di di pesi pataticolo fino ai cosa facciamo andiamo a prendere la libreria che è presente all'interno di questo sistema e utilizzando la nostra struttura di vostri siamo in grado di costruire una libreria tra l'alibi dell'affinamenti che traffico ovvero che modifica i contenuti della Liberia presente all'interno di di costi quindi proseguiamo come fa questo software e in questa slide possiamo guardare brevemente diciamo i risultati utilizzando sempre il benchmark pari Breeze due e sull'asse sulle ordinate abbiamo il guadagno che abbiamo utilizzando adito a stadio e piuttosto che ti costi e abbiamo suddiviso questo gruppo Db sequenze in short Beady Bell onde rispetto alla lunghezza
E minore il venticinque per cento si piglia un'identità inferiore al venticinque per cento vedi quarantuno identità compresa tra venti e quaranta e maggiore il trentacinque per cento possiamo vedere che per sequenze brevi e particolarmente
Diciamo abbassa similarità abbia un guadagno particolarmente alto quindi a uno tulle perfetto una linea netto di bio sequenze
Bene in particolare vorrei sottolineare che l'allineamento a bassa similarità è uno dei problemi che i difficili con cui la maggior parte dei delle dei degli algoritmi basati sulla linea vedo progressivo si scontrano
Qua abbiamo chiaramente un altra batteria di risultati presentati e concludendo vorrei dire che assieme anche ai nostri volendolo ci abbiamo condotto un'ampia validazione biologica di questo metodo non da leggere direttamente
Su gli alimenti abbiamo osservato che la qualità degli degli elementi prodotti da Antitrust al due risulta essere superiore a quelli ti confidi in quanto ci siamo e si presenta più raramente il fenomeno delle delle basi sono alte
Ovvero è un alimento più compatte quindi più significativo dal punto di vista biologico
Abbiamo anche condotto una validazione
Assieme
Ai biologi utilizzando anche il Tpg come ieri ha presentato il dottore
Ragusa e anche la so due
Quindi come ultima cosa l'Antitrust al migliora la velocità dell'allenamento dai risultati dal punto di vista biologico significativi quindi che hanno senso e in particolare antipasto al due migliora di netto le performances del software Titti costi una versione parallela di questo sistema in fase di sviluppo e siamo diciamo stiamo indagando su altre applicazioni biologiche grazie
Bene ci sono domande su questo presentazione
No previamente un complimento per la l'acqua la qualità della presentazione per o persino la sensazione di aver capito ma la domanda in la domanda e sul sito e disponibile society sarebbe nel software
Diciamo attualmente la nuova versione antitrust al due la stiamo preparando ciò presto la troverete sul sito attualmente c'è la versione di Antitrust alle disponibile siete invitati tutti attestarlo e ad utilizzarlo né
I vostri studi invitò quindi a visitare spesso il nostro sito per può essere ci sono sempre lavori in corso aveva Breve proprio poche settimane saremo in grado di diciamo pubblicare questo software andito assai due ed è particolarmente interessante
Deve essere il non ci sono altre domande o con mente grazie ancora zia penso che possiamo passare dunque l'ultima presentazione del sessione e cioè Colangelo Ceriani Finotti scambio Uzzi Albertina e materiali Milano Bicocca
Il mio approccio Foppolo braccia più le fiction opere combinazioni non l'ho fatto e mammaria al sax
Buongiorno
Niente è un piacere presentare questi dati prima di tutto poi fare iniziare con un'introduzione sulle Agf e sul suo ruolo biologico nel sistema nervoso
Anche per sottolineare quali sono le motivazioni che rendono questa proteina
Estremamente interessante dal punto di vista farmacologico e biotecnologico
Inizierei col dire che lei GF il prototipo della famiglia delle in euro Trophy Inés
In pratica è stato scoperto circa cinquanta anni fa dalla professoressa Rita levi Montalcini
La famiglia De Leo la tua fine include le in GS aprire il diviene essa rinuncio Fink Centro FIT for fare una neutro Finzi Xun e sono dei fattori estremamente importanti sia per lo sviluppo che per la funzionalità del sistema nervoso centrale e periferico in quanto regolano la sopravvivenza
E la differenziazione di specifica popolazioni neuronali
In particolare il suo periodo elegia e ci occupiamo della produzione di energia F
è una proteina o modi merita di ventisei chilo d'altronde formata da due vita Chance di centodiciotto amino acidi che derivano dal processamento di un precursore di trecentoventisette amino acidi che include la sequenza leader e la Pro sequenza essenziali per il processamento e per la secrezione della proteina
La la proteina attiva comunque attiva dal punto di vista neuro trofico e il beta e nei GF
Infatti anche ieri il professor Cattaneo sottolineava che il lavoro del della Hempstead pubblicato nel due mila uno in cui dicevano che la
Il promo LCS ha invece è un'attività otto ottica nei confronti delle cellule neuronali e agisce attraverso il recettore Pisa l'intifada e soprattutto quando c'è una dama regolazione del recettore specifico tratti infatti le neutrofili Inés
Agiscono mediante l'interazione con due differenti recettori il ti senti fai che praticamente un membro della famiglia del antichi emerso Sector Tumor mento si X-Factor Sector
E praticamente lega con uguale affinità
Tutte le neutro fine
E e in particolare mancanza di trattati recettore tra cattiva appunto l'apoptosi
Invece il recettore specifico per le neurotossina il recettore attracca che appartiene a una in glicoproteina transmembrana che appartiene alla famiglia dei recettori tirosina chinasi C
In pratica sono specifici per ognuna il trachea quello specifico per l'Energia F il legame dell'Energia F alla alla porzione extracellulare al dominio extracellulare determina la dimerizzazione del recettore con trasposto radicazione della subunità catalitica tiro si inchina Sica e quindi attivazione del pathway Ras macchine ASI
Che essenziale per la crescita e la differenziazione
Neuronale e poi contemporaneamente attiva anche il pacco vede l'Ascoli Panucci gamma e dell'Appia idrica inizia importante per la Survival diciamo
Interventi survival
Dal punto di vista funzionale lei GSA sul svolge diverse funzioni non solo nel sistema nervoso centrale e periferico
Adesso le vediamo in pratica nel sistema nervoso centrale essenziale per la differenziazione la sopravvivenza dei neuroni colinergici dal base for Brain sono quelli che degenerano
Nell'Alzheimer e che sono responsabili del dei deficit cognitivi caratteri che caratterizzano questa malattia
Inoltre sembra che l'energia che protegga anche in euro ogni Nigro stria tali dalle lesioni e cito tossiche e poi pare che abbia anche una funzione di in un sulla un'attività sulla maturazione degli oli godendo crocicchi
E in particolare la produzione della proteina balli cannellini Ka e quindi nella produzione della Vendraminelli inizia e quindi potrebbe avere un ruolo nella sclerosi multipla
In ogni caso le inchieste possa scusate era stato scoperto cinquant'anni fa conto dalla Rita levi Montalcini
Come il fattore Nevano traffico essenziale per i neuroni sensitivi simpatici del sistema nervoso periferico e quindi questi sono i neuroni che degenerano in una vasta gamma di neuropatie periferiche potrebbe avere un ruolo terapeutico rilevante per questo per questo tipo di malattie
Non bisogna poi dimenticare che ha un ruolo anche nel sistema immunitario come modulatore delle risposte infiammatorie da parte di macrofagi linfociti e cervelli Ali sistema nero Indro doppino
Come modulatore delle risposte da stress
Quindi tutte queste evidenze sperimentali raccolte in tanti anni sottolineano l'importanza terapeutica il potenziale terapeutico delle Agf
Non soltanto per l'ENEL loro degenerazioni del sistema nervoso centrale quindi l'Alzheimer e tutte le malattie correlate l'invecchiamento ma anche per le neuropatie periferiche
Che hanno una una vasta gamma di agenti eziologici come per esempio di sì Metabolism mi come per esempio diabete oppure fattori traumatici agenti Neuro tossici quali per esempio i farmaci
Citostatici che vengono utilizzati nel trattamento al antitumorale o anche a infezioni virali come quelle lei c'hai vinto poi potrebbe avere anche un ruolo terapeutico nelle malattie autoimmunitarie come dicevo io
Come dicevo poc'anzi nella modulazione delle risposte infiammatorie come anche nel caso delle allergie e anche addirittura nella notte CIA sembra che promuova lo sviluppo del follicolo pilifero acceleri al celebrando lana false
Recentemente le nel GF Murino è stato utilizzato anche su pazienti da un gruppo di Roma del dottor alone
Praticamente per la rigenerazione di ulcere cutanee corneali che erano refrattaria farmaci convenzionali
In questi casi è stato utilizzato comunque le emergenze Murino perché la proteina ricombinante umana non è disponibile in effetti sono stati effettuati dei tentativi di produrla
Sia in Escherichia coli sia negli evito in success e anche in cellule di mammifero però in ogni caso o la la
Il prete di produzione c'è la consulti
La parola
La il riti protezione non gli ha il termine in ogni caso oppure l'attività biologica non erano non erano erano abbastanza basse e quindi praticamente non era appropriato per te propositi terapeutici insomma scopi terapeutici era questo quindi deriva l'interesse biotecnologico per la produzione di questa proteina ricombinante che potrebbe avere diverse applicazioni
La nostra strategia sperimentale consistita nel clonaggio del gene dell'ENEL GF umano a partire da una libreria di poca
Da ippocampo una una si tiene i human laica di tipo campo mediante PCR
E il frammento il ci tiene a delle richieste che comunque include tutto lesione tre che contiene anche la Pro sequenza e la sequenza leader esatto sub nato in due lettori di espressione per cellule di mammifero il PC tiene a tre
Che è stato utilizzato per
Espressione costitutiva il PTR non si vede bene per il rettore PTR lette tosto per la produzione per l'espressione regolata dalla proteina
In questa diapositiva mostra cioè questi costrutti sono stati utilizzati per tra aspettare stabilmente tre differenti linee cellulari di mammifero
E qui sono rappresentati i livelli di produzione a a di secrezione in pratica in nelle tre differenti linee cellulari
Si può vedere a che nelle Cossa dopo che sono state trasportate collettore PC tiene a tre i livelli di espressione di produzione della proteina sono abbastanza bassi di circa venti
Venti trenta nanogrammi perenne nelle
Che corrispondono a circa sedici danno grammi per dieci a cinque Cellule al giorno e sono pressoché comparabili ai livelli di produzione ottenuti precedentemente in precedenti studi mentre invece i livelli di produzione secrezione della proteina aumentano né lei l'attenta of tra aspettate con il vettore PTR
Dove aumenta di circa due-tre volte questa è la media di attimi quattro differenti cloni
E i livelli però sono notevolmente aumentati in maniera particolare nelle illa tentò su Clooney settantatré dove si ottiene un livello di produzione di circa quattrocento quattrocentocinquanta nanogrammi di proteina
Perenne né con un rete di produzione di centoquattro nanogrammi per dieci alla cinque cellule al giorno
La produzione aumenta invece notevolmente nelle mesto tetto offrono rose embrioni fabbro Blast in cui si raggiunge una produzione di circa due mila
Nanogrammi di proteina perenne nelle in particolare sono stati selezionati tue cloni il clone ventuno venti e ventidue in scusate in cui si raggiunge una produzione di circa nove microgrammi di proteina al giorno in queste cellule in rete di produzione per numero di cellule anche aumentato di circa tre volte rispetto alle il latte Toaff
Ed è di circa trecento nanogrammi per dieci a cinque cellule al giorno nonostante in queste cellule venga utilizzato lo stesso vettore d'espressione usato per lei la la spiegazione di questo aumento di produzione potrebbe essere sia l'anima cellulare in parte anche il fatto che
Ha queste cellule presentano un un tempo di duplicazione di circa tre volte maggiore rispetto alle altre linee utilizzate circa centoquattordici ore solo per Lippi catarsi quindi
Vediamo come c'è un aumento di produzione della proteina
Lei la settantatré e le innesto rappresentano diciamo il sistema ideale per produrre questa proteina ricombinante in quantità abbastanza elevate
La proteina prodotta e biologicamente attiva infatti induce la folla la differenziazione delle PC dodici che sono un modello neuronale in vitro in pratica sono delle feocromocitoma che in presenza di che esprimono entrambi i recettori per l'Energia F e quindi in presenza di Agf differenzia notevolmente queste sono cellule PC dodici
Incubate per uno carnalità Connery Emilio incondizionato da cellule che producono IGF in questo caso erano le corse
Sono altamente differenziate contrariamente a quelle che erano incubate con il medium condizionato delle Cellule tra scattate con il vettore vuoto Nemo transfert senza il il le regie affari con Vinante umano induce anche la fosforilazione del recettore tra Kaye
Infatti
Non si vede molto bene qua comunque
Delle cellule PC dodici vengono incubate sono state incubate per cinque minuti con il mi di un condizionato delle cellule in già scossa Helen e praticamente esprimono livello di fosforilazione in questo è stato fatto mediante esperimenti di muro precipitazione comparabili a quelli ottenuti con le nel GF
Murino indisponibile commercialmente mentre invece non c'è
Fosforilazione né in quelle esposte al medium dell'emo senza né tanto meno nel controllo quindi questo significa che la proteina inattiva e attiva il corretto pathway di traduzione abbiamo anche
Mi utilizzato un altro sistema in in vitro
Perché si tratta dei gangli delle radici dorsali i DRG
E
Che sono appunto a un modello di neuroni sensitivi in pratica potete osservare che il il quelli gangli in presenza di Mindy un condizionato dalle cellule producono le Agf
Sono altamente differenziate presenta un livello di differenziazione simile a quello indotto dall'ENEL GS Murino mentre invece nel controllo il gambero presenta soltanto stesa proliferazione di fibroblasti dovuta alla presenza del siero
Il il gol del nostro del nostro laboratorio comunque quello di produrre la proteina su larga scala mi interrogo scopi terapeutici e quindi per un processo di schede in data abbiamo pensato di utilizzare un iniziale sistema che consentisse una in colture cellulari ad alta densità e abbiamo utilizzato in mini permarrà di Oria Actors sistema anziché praticamente sono dei mini Pio reattori costituiti da due moduli un modulo di produzione che contiene due membrane per l'adesione delle cellule
E un modulo di nutrienti per nella per diciamo garantire un supply di nutrienti alle cellule
E due moduli sono separate cioè collegati tra loro e separati da una membrana semi permeabile con un cut-off il dittatore
Vinti
Dodici virgola cinque chi loda Alton
Mentre lo scambio di in un triennio cioè di lo scambio ossigeno CO due avviene tramite una membrana di silicone questo sia
Per il modulo di produzione e sia per la il Catto del del modulo di nutrienti
Noi siamo partiti da circa dodici milioni di cellule che continuano a produrre nel GF per circa due tre settimane il medium viene prelevato
Ogni giorno da questi l'OCSE che sono situati qui sotto
Viene sostituito con miti un fresco mentre invece il medium nel modulo dei nutrienti viene cambiato ogni cinque sei giorni il sistema è fatto ruotare su un Timing Buysse tale che
Per quanto riguarda la produzione possiamo vedere mi profili produzione questa è la quantità di energia F prodotta giornalmente si parte da otto milligrammi fino a quaranta milligrammi di proteina e qua invece il Time costi di produzione in tre in milligrammi totale di proteina si arriva fino a otto milligrammi comunque questo è un esempio di mini Perna in alcuni siamo arrivati a produrre anche fino a venti milligrammi di proteina quindi la produzione giornaliera
è di circa quaranta di C quaranta microgrammi con un una totale produzione di otto venti milligrammi per ogni ministero ma
Infine abbiamo aspettato un sistema abbastanza semplice per la purificazione che consiste nella dialisi del Midi un di coltura né né un primo passaggio su una colonna scambio ionico e Spicer fa rossa associato a un sistema in sé PLC poi una successiva dialisi è un secondo passaggio di purificazione su colonna idrofobica
Le le le frazioni glielo atti vengono analizzati per il contenuto di proteine ricombinante mediante questa in Lotto dottor Bilotta e la quantificazione finale del prodotto mediante e Liza questi sono del
Analisi delle frazioni cromatografica questo è un western Blotter delle frazioni daglielo atti nella colonna uno come si vede le Agf se crede e Luitpold a partire dalla frazione dodici fino alla ventidue ventitré e queste sono raccolte fate passare sulla seconda colonna le cui frazione vengono analizzate mediante dotto Blotter
Qui rappresentata diciamo la un po'alla la
In rete di problemi di purificazione in pratica partendo da circa sette mila e cinquecento microgrammi di proteina se tiene circa il trenta per cento nella prima colonna il dieci per cento nella seconda
La proteina non è perfettamente pura come potete vedere da queste sia specie ci sono un po'altre proteine però la quantità di proteina ricombinante abbastanza
Elevata in ogni caso allo scopo di eliminare contaminanti sierici sia durante il procedimento di purificazione del prodotto finale esaltata è stata anche la possibilità e la ha la possibilità di fa crescere le cellule in condizioni di siero ridotte
E c'è una diminuzione comunque fino all'ottantasei per cento al cinque per cento di siero e poi sessantacinque cinquantacinque per cento al due per cento e l'uno per cento di Siino
Mentre invece l'assenza di siero viene tollerata solo in presenza di miti un uomo immane comunque la
La la produzione di proteine ricombinanti diminuisce notevolmente
Infine proprio quel quel che è uno dei nostri progetti sarebbe quello di applicare queste cellule per una un modello di terapia cellulare delle neuropatie periferiche
In pratica abbiamo testato la responsabilità del del promotore alla dozzina ciclina che un analogo della tetraciclina e partendo da concentrazioni crescenti di dovendo Xi ciclina vediamo che in pratica il promotore viene spento una concentrazione di un anno gramo perenne le a quarantotto ore la proteina ricombinante
Scusate
Purificata nascere malissimo ma induce la differenziazione ideologicamente attiva induce la differenziazione delle PC dodici anzi di processi in euro ITC sono abbastanza lunghi anche
Più che nel nelle cellule trattate con le leggi il fiorino commerciale
Quindi in conclusione questi dati indicano una produzione ottimale di energia se nelle cellule di mammifero soprattutto con il vettore PTR grazie alla presenza di un promotore abbastanza forte
La differenza tra lei la elemento potrebbe essere dovuta a questa differenza nel tempo di duplicazione delle cellule la proteina ricombinante secreta nella sua s'informano attiva e biologicamente attiva in quanto induce la sopravvivenza e la differenziazione PC dodici e dei DRG come anche la fosforilazione recettore tra Cary i livelli di produzione sono abbastanza alti il sistema mini per me
Aumenti alla produzione di cinque circa cinquanta cento volte rispetto al sistema convenzionale di coltura in fresca e poi abbiamo saltato questo sistema di cui Ficacci nella proteina purificata biologicamente attiva grazie
Pareva
Voleva far vedere quest'ultima diapositiva con il nostro gruppo con la professoressa Rita levi Montalcini che ci ha venuta a trovarci la professoressa Alberghina professor Marte Gani collaboratori dottoressa Finotti Nicla Ceriani io grazie
Grazie ci sono domande su questo presentazione
Qualitativa vedo se posso io forse che è chiaro che la proteina ricombinante ha un'attività biologica chiedo
Per conseguenza del tipi cellulari che avete impiegato voi ritenete che anche su base quantitativa il prodotto sia efficace tal quale il prodotto naturale per così dire
Io cioè questo non l'abbiamo ancora attestato abbiamo abbiamo adesso da cominciare gli esperimenti in vivo
Però il fatto che funzioni abbastanza bene sulle cellule PC dodici dei DRG che sono diciamo il modello in vitro per lo più utilizzato induce a pensare che funzionerà anche in vivo anche perché
La la dose richiesta per la differenziazione delle cellule anche abbastanza bassa
Circa trenta nanogrammi di proteina perenne il neanche diciamo comparabile a quella delle GS commercialmente disponibile
Così ASI quello si era fatto sulla mensa consigliamo un po'meglio senza si erano
Le messa già alle Islam lei è l'abbiamo fatto sia sulle i la che le messa in pratica le uniche differenze che abbiamo osservato tra le due linee cellulari e sono la diciamo la sopravvivenza e la produzione in assenza totale di siero nell'ottima però sostanzialmente i livelli di produzione diventano molto estremamente bassi in assenza di siero
Altri quesiti
Se no grazie ancora e in in generale
Visto che siamo arrivati in fondo alla alla mattinata
Credo assieme la protesta per professoressa alberghiera ringrazio dunque tutti gli speaker ed evidentemente i presenti che avete avuto la pazienza e restare conosceva questo Graziano